O-PTIR技术
O-PTIR (Optical Photothermal Infrared)是一种快速简单、非接触式的光热红外技术，突破了传统IR衍射的极限。该技术不依赖于残留的IR 辐射分析，而是通过检测因本征红外吸收引发的样品表面快速的光热膨胀或收缩，来反映微小样品区域的化学信息。
O-PTIR 技术已广泛应用于生命科学中的各个领域，尤其是细胞与亚细胞水平的原位分子结构研究，如检查亚细胞位置的淀粉样蛋白折叠。
非接触亚微米分辨红外拉曼同步测量系统——mIRage
美国PSC公司基于新型光热红外（O-PTIR）技术，研发了全新非接触亚微米分辨红外拉曼同步测量系统——mIRage。设备不仅具备传统FTIR的特性，可以对物质的分子结构进行解析，还克服了传统红外空间分辨率不足的问题，其分辨高达500 nm，可在亚微米尺度上实现单个细胞与组织的无标记含水分析，如对单个细胞内蛋白、脂质等生物大分子的无标记探测。本文将结合三篇高水平文献概述该技术在亚细胞水平无标记成像的能力。
非接触亚微米分辨红外拉曼同步测量系统——mIRage
一、单神经元细胞中β淀粉样蛋白无标记成像分析
瑞典隆德大学的Oxana Klementieva与Gunnar K. Gouras团队使用非接触亚微米分辨红外拉曼同步测量系统——mIRage和X射线荧光直接对神经元中的微量元素和相关分子结构进行化学成像，在这一研究中该团队使用mIRage对单神经元细胞中β淀粉样蛋白的分布和结构进行了分析，该成果在2021年以Correlative optical photothermal infrared and X-ray fluorescence for chemical imaging of trace elements and relevant molecular structures directly in neurons为名发表在Light: Science and Applications（影响因子20.6）上。
在这项研究中，作者结合了两种位于电磁波谱两端的成像模式用于直接评估单个神经元中的结构和化学信息。通过非接触亚微米分辨红外拉曼同步测量系统——mIRage和同步加速器 X 射线荧光 (S-XRF) 纳米成像技术的无标记超分辨率微光谱进行亚细胞成像并捕获了同一神经元中β淀粉样蛋白的纤维形式。该研究发现在原代AD样神经元中，铁簇与升高的淀粉样蛋白β片层结构和氧化脂质共定位。
该团队首先使用mIRage可视化了β淀粉样蛋白片层结构和氧化脂质的分布（下图a）；随后，使用S-XRF可视化了相同神经元中金属离子的分布（图b）。通过拟合mIRage和S-XRF图像可以发现金属铁簇的位置与升高的β淀粉样蛋白片层结构和氧化脂质高度相关（图c和d）。
该研究运用mIRage/S-XRF联合单细胞成像技术，成功证实了聚集铁与升高的β淀粉样蛋白片层结构共定位的显著相关性，表明使用 Aβ(1–42) 治疗可能导致Fe失衡，进而可能引发脂质氧化。
二、脑组织切片中β淀粉样蛋白无标记成像分析
上述团队瑞典隆德大学的Oxana Klementieva继续使用非接触亚微米分辨红外拉曼同步测量系统——mIRage表征了新提取的AD动物模型的脑组织，对淀粉样蛋白结构形成进行了化学成像分析，该成果在2022年以Label-Free High-Resolution Photothermal Optical Infrared Spectroscopy for Spatiotemporal Chemical Analysis in Fresh, Hydrated Living Tissues and Embryos为题发表在Journal of the American Chemical Society（影响因子14.4）上。
在该研究中，作者使用非接触亚微米分辨红外拉曼同步测量系统——mIRage检测了新提取的含水组织，从而避免了传统红外检测制样中必须要通过大量操作排除水分子干扰而无法对蛋白分子进行原位结构研究的弊端。
结果表明，mIRage可对从各种器官（包括活体大脑和肺组织）中提取的未处理、完全水合的组织活检样本进行化学成像分析。借助mIRage，该团队跟踪了功能性脑组织中淀粉样蛋白随时间的结构变化，首次观察到新形成的淀粉样蛋白的出现，而淀粉样蛋白结构在标准固定和脱水程序后发生了改变。
如下图所示，该团队以对 APP/PS1模型小鼠脑切片中相同的淀粉样斑块进行时间分辨观察。为了可视化 β淀粉样蛋白的片层结构，该团队获取了 1656、1630 和 1680 cm-1 频率的红外图，这是淀粉样蛋白的双波段特征。由于氧化脂质先前与淀粉样蛋白结构相关，该团队还获取了频率为 1740 cm–1 的图谱，以使用 1656 cm–1 图谱作为相应比率图谱的分母来检测氧化脂质 (图C)。该团队在该时间点观察到具有β片层结构的新小斑点的形成 (图A下中箭头指示的2张图像)，其中反向平行β片层结构含量较高(图 B下，箭头所示)。新β片层结构的出现伴随着氧化脂质的存在增加，而氧化脂质的存在伴随着 AD 组织中的淀粉样蛋白聚集（图C、D）。
该研究证明了非接触亚微米分辨红外拉曼同步测量系统——mIRage无需标记即可直接对新鲜的生物样本进行检测，分辨率达亚微米水平，代表了生物组织原位化学成像分析技术的新突破。
三、单细胞脂质代谢成像分析
加州大学圣巴巴拉分校的Kenneth S. Kosik研究组以棕榈酸叠氮化物（azide-PA）作为探针，使用非接触亚微米分辨红外拉曼同步测量系统——mIRage检测体外细胞模型中新合成的脂质以研究细胞脂代谢。该成果以Single-cell mapping of lipid metabolites using an infrared probe in human-derived model systems为题发表在Nature communication（影响因子16.6 ） 上。
在该研究中，作者构建了一个单细胞代谢成像平台，能够在各种人类衍生的 2D 和 3D 培养系统中以高特异性直接成像脂质代谢。通过加入叠氮化物标记的红外探针（azide-PA），可用作核苷酸的修饰标记，脂肪酸代谢的分子探针；azide-PA加入培养基后，可被细胞利用合成甘油三酯，磷脂和固醇类。mIRage检测azide-PA的光谱结果显示和PA相比，其在2100cm-1具有叠氮基团的吸收峰，因此azide-PA非常适合用于检测细胞内的脂质分布。该团队通过此体系在前颗粒蛋白敲低的人类诱导多能干细胞及其分化的小胶质细胞中发现了上调的脂质代谢。
如下图所示，该团队将hiPSC与神经胶质细胞在含有azide-PA的培养基中培养24h后，通过mIRage成像发现，神经胶质细胞在2096 cm-1和1744 cm-1的信号强度（图A&图B），及总脂质/蛋白比（1740/1650）与新合成脂质/总脂质比（2096/1740）均高于hiPSC（图C&图D），表示在hiPSC分化过程中脂质的合成更加活跃，脂质的合成可能与早期脑发育有关。
以上研究结果表明， mIRage可以在亚微米水平进行高分辨率的单细胞化学成像分析，O-PTIR技术与红外探针结合的单细胞代谢成像，将带来更多生物领域的新发现，助力开发更有效的疾病疗法。
mIRage的特有优势：
• 亚微米空间分辨的红外光谱和成像（~500 nm）；
• 与透射模式相媲美的反射模式下的图谱效果；
• 非接触测量模式—使用简单快捷，无交叉污染风险；
• 很少或无需样品制备过程(无需薄片), 可测试厚样品；
• 可透射模式下观察溶液中的样品；
• 实现同时同地相同分辨率的IR和Raman测试；
• 荧光显微成像实现荧光标记样品快速定位。
O-PTIR光谱测试原理
mIRage-LS应用领域
1. 环境微塑料
微塑料颗粒（~600 nm）的O-PTIR光谱及成像分析
(引自Microscopy Today, 2022, 17, 3, 76-85)
2. 高分子材料
1210 cm-1处采集的PP/PTFE的O-PTIR光谱和显微图像
(引自Materials & Design, 211 (2021), 17, 110157)
3. 半导体
薄膜晶体管显示器中污染物的O-PTIR分析
器件表面缺陷的红外和拉曼光谱同步（同时间、同位置）分析
(引自Microscopy Today, 2020, 28, 3, 26-36)
4. 生命科学
脑组织的明场显微图像、O-PTIR光谱及成像分析
无荧光标记条件下单个细胞的O-PTIR显微光谱及成像分析
(引自Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 43 (2022) 102563)
5. 文物鉴定
柯罗19世纪绘画作品中锌皂异质性的O-PTIR显微光谱及成像分析
(引自Anal. Chem. 2022, 94, 7, 3103–3110)
mIRage国内部分发表文章一览
南京大学借助mIRage建立了一种新型的塑料表面亚微米尺度化学变化表征方法。该工作发表在知名期刊Nature Nanotechnology上。
中国农业大学借助mIRage成功实现对玉米粉中痕量微塑料的原位可视化表征。该工作发表在Science of the Total Environment上。
中国科学技术大学借助mIRage研究微塑料。该工作发表在Environmental Science & Technology上。
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