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清砥量子科学仪器（北京）有限公司
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Lavision双光子共聚焦显微镜应用案例：多焦点扫描与光激活蛋白在核转运与调控研究中的应用
2890 人阅读发布时间：2022-08-02 11:25
Multifocal two-photon laser scanning microscopy combined with photo-activatable GFP for in vivo monitoring of intracellular protein dynamics in real time
Joerg Martini a,1, Katja Schmied b,1, Ralf Palmisano b, Katja Toensing a,
Dario Anselmetti a,¤, Thomas Merkle b
a Department of Experimental Biophysics and Applied Nanoscience, Faculty of Physics, University of Bielefeld, 33615 Bielefeld, Germany
b Department of Genomic Research, Faculty of Biology, University of Bielefeld, 33594 Bielefeld, Germany
Received 11 August 2006; received in revised form 20 December 2006; accepted 21 December 2006
Available online 17 January 2007
Abstract
我们运用多焦点双光子激光扫描显微镜来进行局部和选择性的蛋白激活以及细胞内蛋白动态的的量化调查。局部激活使用光激活绿色荧光蛋白 (pa-GFP) 和光学双光子激发来实现，以调查实时原位的细胞内动态。这个过程对于深入理解和建模活细胞内的调控和代谢过程其重要。作为范例，既包含了一个核输入信号又包含了一个核输出信号的拟南芥 MYB 转录因子 LHY/CCA1-like 1 (LCL1) 被定量化调查。我们使用了由质粒编码的光激活绿色荧光蛋白 (pa-GFP) 融合蛋白和一个红色荧光转染标记联合转染的烟草 BY-2 原生质体，并 pa-GFPLCL1 在核内光激活后的快速向核外输出。作为对照，一个 LCL1 核输出阴性突变体仍然被束缚在核内。我们确定了由激活 pa-GFP-LCL1 的双向核运输和 pa-GFP 的扩散分别导致的核内荧光下降的 51s 和 125s 的平均时间常数
2. 材料与方法
2.1. 并行的 64 焦点双光子激光扫描显微镜
Pa-GFP 的激活和荧光的原位检测，通过基于根据蛋白动态监测需求改进的商业化系统 (TriM-Scope, LaVision-Biotec; Martini et al., 2005; Nielsen et al., 2001) 多焦点 2 光子 LSM 检测 (Fig. 1). 64 焦点 2 光子 LSM (Martini et al., 2006) 包括一个倒置光学显微镜和一个可以产生从 760nm 到 960nm 的 100fs 激光脉冲的由固态激光器泵浦的锁模飞秒 Ti:Sa 激光器。用于激活和成像循环的波长选则通过一个允许 5s 内转换波长的 ahome-built screw motorization 来实现。
激光扫描单元 (TriM-Scope, LaVision-BioTec) 包括一个内置的预啁啾部分以补偿激光脉冲的色散，一个光束分光器部分和振镜扫描器。通过选择一组 10 个 100% 反光镜和 50% 分光镜，激发的 NIR 激光束在样品中被分为 1, 2, 4,……, 64 个激发焦点。这些数目可调的焦点在显微镜物镜 (UPLAO60XW3/IR, NAD1.2;Olympus) 的焦平面上被激光扫描单元中的 2 个扫描镜扫描。整个激活和测量过程在一个温度可控环境中在 293±1K 下进行。因为在保持每个焦点的能量沉积低于样品的退化限的同时，多个焦点产生了相对高的双光子诱导荧光产额，成像可以 30ms 的时间分辨率进行。图像用一个背照明的 EMCCD 相机 (IXON DV887ECS-UVB, Andor Technology) 以 non-descanned 方式获取。激发的 NIR 激光束被引导通过一个分光镜 (2 光子-Beamsplitter, Chroma) 到物镜的后光圈上。为了成像深度和光谱荧光切片，倒置显微镜采用了机械聚焦驱动 (MFD, Marzhauser) 和一个程序控制滤波轮 (LaVision-BioTec)。数据获取和实验控制由 TriM Scope 的软件包 Imspector(LaVision-BioTec) 执行。操作和处理 5 维的数据列，包括光谱和时间数据轴，使用软件包 Imspector (LaVision-BioTec)，ImageJ (Rasband, 1997) 或 Imaris (Bitplane).
Fig. 1. 多焦点 2 光子激光扫描显微镜的原理图 (1) Tsunami Ti:Sa 激光器 (波长可调) 由固态 Millenia X 激光器泵浦 (均来自 Spectra Physics), (2) 多焦点激光扫描单元 (TriM-scope, LaVision BioTec), (3) 分光镜 (2 光子-Beamsplitter, Chroma), (4) 短波通过滤波轮 (2 光子-Emitter, Chroma), (5) 物镜 (UPLAO60XW3/IR, NA D 1.2; Olympus), (6) 样品中可选择数目的荧光焦点, (7) 倒置光学显微镜 (IX 71, Olympus), (8) 滤波轮 (滤波轮, LaVision BioTec) 装备带通滤波片 D 605/55 (Chroma) 用于检测 Ds-Red 和 HQ525/50 结合 HQ510/20 (均来自 Chroma) 以检测 pa-GFP, (9) 背照式 EMCCD-camera (IXON DV887ECS-UVB, Andor Technology) 在 NDD 光路中, (10) 荧光灯 (HBO 50, Zeiss), (11) 带通激发滤波轮 D 540/25 (Chroma) 用于 Ds-Red 或带通激发滤波轮 HQ 480/20 (Chroma) 用于 pa-GFP.
3. 结果
Fig. 2. 含有核输入输出信号的拟南芥转录因子 LCL1 (分别为 NLS, NES). 由质粒编码 GFP 融合蛋白转染的烟草 BY-2 原生质体。通过单光子共聚焦激光扫描显微镜分析的 GFP 融合蛋白稳定态定位。(a) GFP-LCL1 揭示的核与细胞质间的分区
(b) 使用核输出抑制剂 leptomycin B (LMB) 孵育后，由于功能性 NLS 的存在，GFP-LCL1 的稳定态分区剧烈转化为几乎完全分布于核中。(c,d) 对照，LMB 对单独的 GFP 没有影响。(e) GFPLCL1(NESm) 中，它的 NES 的点突变造成的 LCL1 的核输出活性削弱同样导致了 GFP 融合蛋白在核内的聚集。(f) 与 (e) 中同一个原生质体的透射光与 GFP 荧光成像的叠加标尺为 10um (g) 作为对照的 GFP-NLS 在核内的增加。(h) 同一原生质体的 GFP-NLS 绿色荧光蛋白和作为转染标记的 Pra1-DsRed (At2 g38360) 红色荧光蛋白的叠加。
Fig. 3. pa-GFP 在一个活原生质体内的自由动态扩散。选出的 5 幅表达 pa-GFP 的烟草 BY-2 原生质体的单光子透射荧光图像。(a) 实验开始，未激活 (b) pa-GFP 的双光子激活期间 (c–e) 双光子激活后，所示时间点。(a) 核内（红虚线）的 pa-GFP 在双光子激发前平均荧光很难被检测到。使用 4 个平行焦点 (10 mW at 800 nm 每焦点) 的持续 3s 的飞秒激光对一个 7X8um 的区域进行 pa-GFP 2 光子激发开始 (b) 激发后很短时间内检测到一个强的荧光信号 (c–e) pa-GFP 从核内向细胞质的扩散被监测，直到两组分间达到平衡。荧光强度标尺显示在每幅图的左边。
Fig. 4. 在核内被光激活后，pa-GFP 从核内向细胞质扩散的量化分析。在激活前，核内（ROI）平均的 1 光子荧光强度非常低（平均强度～300）. 在 26s 和 29s 间的时间点，由飞秒激光激活诱导的荧光增强在图上进行了监测。 与光激活前相比，平均荧光强度是之前的大约 5 倍，伴随着 ROI 内的荧光降低。在个地方，监测到的细胞核内荧光下降是由于激活的 pa-GFP 向细胞质内的扩散。后来，光漂白变得显著。双指数拟合非常近似地拟合了整个荧光下降过程（红线）。以此方式计算出这个实验中 175s 的扩算时间常数。
Fig. 5. 烟草 BY-2 原生质体中 At2 g38360-DsRed 的定位和平行双光子荧光显微镜对 pa-GFP 的 3D 监测（64 foci, 920 nm, 240 mW)。(a) 双光子荧光下降的量化分析，给出了一个 123s 的扩散时间常数。Figs. 3 and 4 中的数据源于两个不同的实验，解释了荧光值的对差异（不同的表达水平）和统计分析。 (b) At2 g38360-DsRed 作为转染标记在核中 pa-GFP 激活前的荧光 (c) At2 g38360-DsRed 和 pa-GFP 数据采集后 400 s 的 3D 荧光图像，清楚显示了荧光团从细胞核向细胞质的扩散。
Fig. 6. 在核内光激活前后, 烟草 BY-2 原生质体内活跃转运的 pa-GFP-LCL1 的 3D 动态监测和量化分析。(a) 在 pa-GFP-LCL1 双光子激发后核内的单光子荧光表明双光子激活荧光增强 (b) pa-GFP 被双光子激活后双指数曲线拟合（红线）的荧光下降量化分析。计算得出的由于主动运输导致的核内 pa-GFP-LCL1 荧光下降的一个 20s 的时间常数 (c,d) At2 g38360-DsRed（转染标记）和 pa-GFP-LCL1 的双色双光子荧光 3D 成像 (c) 核内光激活前 (d) 数据获取后
Fig. 7. 烟草 BY-2 原生质体的核输出阴性突变 pa-GFP-LCL1(NESm) 光激活前后的 3D 动态监测和量化分析。(a) pa-GFP-LCL1(NESm) 被双光子激活后的单光子荧光显示了双光子激活荧光增强和激活后核内荧光其缓慢的下降，反映了 pa-GFPLCL1(NESm) 的核限制 (b,c) At2 g38360-DsRed (转染标记) 和 pa-GFP-LCL1(NESm) 的双光子荧光 3D 图像 (b) 光激活前的核内 pa-GFP (c) 数据获取后 300s 的时间点
Joerg Martini a,1, Katja Schmied b,1, Ralf Palmisano b, Katja Toensing a,
Dario Anselmetti a,¤, Thomas Merkle b
a Department of Experimental Biophysics and Applied Nanoscience, Faculty of Physics, University of Bielefeld, 33615 Bielefeld, Germany
b Department of Genomic Research, Faculty of Biology, University of Bielefeld, 33594 Bielefeld, Germany
Received 11 August 2006; received in revised form 20 December 2006; accepted 21 December 2006
Available online 17 January 2007
Abstract
我们运用多焦点双光子激光扫描显微镜来进行局部和选择性的蛋白激活以及细胞内蛋白动态的的量化调查。局部激活使用光激活绿色荧光蛋白 (pa-GFP) 和光学双光子激发来实现，以调查实时原位的细胞内动态。这个过程对于深入理解和建模活细胞内的调控和代谢过程其重要。作为范例，既包含了一个核输入信号又包含了一个核输出信号的拟南芥 MYB 转录因子 LHY/CCA1-like 1 (LCL1) 被定量化调查。我们使用了由质粒编码的光激活绿色荧光蛋白 (pa-GFP) 融合蛋白和一个红色荧光转染标记联合转染的烟草 BY-2 原生质体，并 pa-GFPLCL1 在核内光激活后的快速向核外输出。作为对照，一个 LCL1 核输出阴性突变体仍然被束缚在核内。我们确定了由激活 pa-GFP-LCL1 的双向核运输和 pa-GFP 的扩散分别导致的核内荧光下降的 51s 和 125s 的平均时间常数
2. 材料与方法
2.1. 并行的 64 焦点双光子激光扫描显微镜
Pa-GFP 的激活和荧光的原位检测，通过基于根据蛋白动态监测需求改进的商业化系统 (TriM-Scope, LaVision-Biotec; Martini et al., 2005; Nielsen et al., 2001) 多焦点 2 光子 LSM 检测 (Fig. 1). 64 焦点 2 光子 LSM (Martini et al., 2006) 包括一个倒置光学显微镜和一个可以产生从 760nm 到 960nm 的 100fs 激光脉冲的由固态激光器泵浦的锁模飞秒 Ti:Sa 激光器。用于激活和成像循环的波长选则通过一个允许 5s 内转换波长的 ahome-built screw motorization 来实现。
激光扫描单元 (TriM-Scope, LaVision-BioTec) 包括一个内置的预啁啾部分以补偿激光脉冲的色散，一个光束分光器部分和振镜扫描器。通过选择一组 10 个 100% 反光镜和 50% 分光镜，激发的 NIR 激光束在样品中被分为 1, 2, 4,……, 64 个激发焦点。这些数目可调的焦点在显微镜物镜 (UPLAO60XW3/IR, NAD1.2;Olympus) 的焦平面上被激光扫描单元中的 2 个扫描镜扫描。整个激活和测量过程在一个温度可控环境中在 293±1K 下进行。因为在保持每个焦点的能量沉积低于样品的退化限的同时，多个焦点产生了相对高的双光子诱导荧光产额，成像可以 30ms 的时间分辨率进行。图像用一个背照明的 EMCCD 相机 (IXON DV887ECS-UVB, Andor Technology) 以 non-descanned 方式获取。激发的 NIR 激光束被引导通过一个分光镜 (2 光子-Beamsplitter, Chroma) 到物镜的后光圈上。为了成像深度和光谱荧光切片，倒置显微镜采用了机械聚焦驱动 (MFD, Marzhauser) 和一个程序控制滤波轮 (LaVision-BioTec)。数据获取和实验控制由 TriM Scope 的软件包 Imspector(LaVision-BioTec) 执行。操作和处理 5 维的数据列，包括光谱和时间数据轴，使用软件包 Imspector (LaVision-BioTec)，ImageJ (Rasband, 1997) 或 Imaris (Bitplane).
Fig. 1. 多焦点 2 光子激光扫描显微镜的原理图 (1) Tsunami Ti:Sa 激光器 (波长可调) 由固态 Millenia X 激光器泵浦 (均来自 Spectra Physics), (2) 多焦点激光扫描单元 (TriM-scope, LaVision BioTec), (3) 分光镜 (2 光子-Beamsplitter, Chroma), (4) 短波通过滤波轮 (2 光子-Emitter, Chroma), (5) 物镜 (UPLAO60XW3/IR, NA D 1.2; Olympus), (6) 样品中可选择数目的荧光焦点, (7) 倒置光学显微镜 (IX 71, Olympus), (8) 滤波轮 (滤波轮, LaVision BioTec) 装备带通滤波片 D 605/55 (Chroma) 用于检测 Ds-Red 和 HQ525/50 结合 HQ510/20 (均来自 Chroma) 以检测 pa-GFP, (9) 背照式 EMCCD-camera (IXON DV887ECS-UVB, Andor Technology) 在 NDD 光路中, (10) 荧光灯 (HBO 50, Zeiss), (11) 带通激发滤波轮 D 540/25 (Chroma) 用于 Ds-Red 或带通激发滤波轮 HQ 480/20 (Chroma) 用于 pa-GFP.
3. 结果
Fig. 2. 含有核输入输出信号的拟南芥转录因子 LCL1 (分别为 NLS, NES). 由质粒编码 GFP 融合蛋白转染的烟草 BY-2 原生质体。通过单光子共聚焦激光扫描显微镜分析的 GFP 融合蛋白稳定态定位。(a) GFP-LCL1 揭示的核与细胞质间的分区
(b) 使用核输出抑制剂 leptomycin B (LMB) 孵育后，由于功能性 NLS 的存在，GFP-LCL1 的稳定态分区剧烈转化为几乎完全分布于核中。(c,d) 对照，LMB 对单独的 GFP 没有影响。(e) GFPLCL1(NESm) 中，它的 NES 的点突变造成的 LCL1 的核输出活性削弱同样导致了 GFP 融合蛋白在核内的聚集。(f) 与 (e) 中同一个原生质体的透射光与 GFP 荧光成像的叠加标尺为 10um (g) 作为对照的 GFP-NLS 在核内的增加。(h) 同一原生质体的 GFP-NLS 绿色荧光蛋白和作为转染标记的 Pra1-DsRed (At2 g38360) 红色荧光蛋白的叠加。
Fig. 3. pa-GFP 在一个活原生质体内的自由动态扩散。选出的 5 幅表达 pa-GFP 的烟草 BY-2 原生质体的单光子透射荧光图像。(a) 实验开始，未激活 (b) pa-GFP 的双光子激活期间 (c–e) 双光子激活后，所示时间点。(a) 核内（红虚线）的 pa-GFP 在双光子激发前平均荧光很难被检测到。使用 4 个平行焦点 (10 mW at 800 nm 每焦点) 的持续 3s 的飞秒激光对一个 7X8um 的区域进行 pa-GFP 2 光子激发开始 (b) 激发后很短时间内检测到一个强的荧光信号 (c–e) pa-GFP 从核内向细胞质的扩散被监测，直到两组分间达到平衡。荧光强度标尺显示在每幅图的左边。
Fig. 4. 在核内被光激活后，pa-GFP 从核内向细胞质扩散的量化分析。在激活前，核内（ROI）平均的 1 光子荧光强度非常低（平均强度～300）. 在 26s 和 29s 间的时间点，由飞秒激光激活诱导的荧光增强在图上进行了监测。 与光激活前相比，平均荧光强度是之前的大约 5 倍，伴随着 ROI 内的荧光降低。在个地方，监测到的细胞核内荧光下降是由于激活的 pa-GFP 向细胞质内的扩散。后来，光漂白变得显著。双指数拟合非常近似地拟合了整个荧光下降过程（红线）。以此方式计算出这个实验中 175s 的扩算时间常数。
Fig. 5. 烟草 BY-2 原生质体中 At2 g38360-DsRed 的定位和平行双光子荧光显微镜对 pa-GFP 的 3D 监测（64 foci, 920 nm, 240 mW)。(a) 双光子荧光下降的量化分析，给出了一个 123s 的扩散时间常数。Figs. 3 and 4 中的数据源于两个不同的实验，解释了荧光值的对差异（不同的表达水平）和统计分析。 (b) At2 g38360-DsRed 作为转染标记在核中 pa-GFP 激活前的荧光 (c) At2 g38360-DsRed 和 pa-GFP 数据采集后 400 s 的 3D 荧光图像，清楚显示了荧光团从细胞核向细胞质的扩散。
Fig. 6. 在核内光激活前后, 烟草 BY-2 原生质体内活跃转运的 pa-GFP-LCL1 的 3D 动态监测和量化分析。(a) 在 pa-GFP-LCL1 双光子激发后核内的单光子荧光表明双光子激活荧光增强 (b) pa-GFP 被双光子激活后双指数曲线拟合（红线）的荧光下降量化分析。计算得出的由于主动运输导致的核内 pa-GFP-LCL1 荧光下降的一个 20s 的时间常数 (c,d) At2 g38360-DsRed（转染标记）和 pa-GFP-LCL1 的双色双光子荧光 3D 成像 (c) 核内光激活前 (d) 数据获取后
Fig. 7. 烟草 BY-2 原生质体的核输出阴性突变 pa-GFP-LCL1(NESm) 光激活前后的 3D 动态监测和量化分析。(a) pa-GFP-LCL1(NESm) 被双光子激活后的单光子荧光显示了双光子激活荧光增强和激活后核内荧光其缓慢的下降，反映了 pa-GFPLCL1(NESm) 的核限制 (b,c) At2 g38360-DsRed (转染标记) 和 pa-GFP-LCL1(NESm) 的双光子荧光 3D 图像 (b) 光激活前的核内 pa-GFP (c) 数据获取后 300s 的时间点